WISSENSCHAFTLICHE PROJEKTE
Die Projektbeschreibungen sind vorbehaltlich späterer Publikationen nicht zitierfähig und ohne Autorennennung von Mitgliedern des DZITM auf die Homepage gestellt worden.

DZITM nationale Projekte
  1. Herstellung und Anwendung autologer Satelitenzellen bei der postoperativen Harninkontinenz
  2. Optimierung der radikalen retropubischen Prostatovesikulektomie (RRP) durch frühe postoperative Entfernung der Anastomosennähte
  3. Fremdkörperreaktionen hervorgerufen durch alloplastische Materialien
  4. Verbesserung der Fremdkörperreaktion alloplastischen Materials
  5. Ileumpouch:  Eine neue und einfache Methode der kontinenten Harnableitung
  6. Multiperforierte Katheter verkürzen die Verweildauer bei der radikalen retropubischen Prostatovesikulektomie (RRP) -Ergebnisse einer prospektiven vergleichenden Untersuchung

DZITM internationale Projekte



 Therapie der refraktären postoperativen Harninkontinenz mit autologen skeletalen Myoblasten (muscle derived cells-MDC)

Hintergrund:
Harninkontinenz, hervorgerufen durch Verletzung des externen Sphinkters ist konservativ nicht therapierbar. Auf der Basis einer Therapie mit MDC gemäß §4a AMG haben wir ein bundesweit rekrutiertes Patientengut mit postoperativer, refraktärer, drittgradiger Harninkontinenz behandelt.

Methoden:
Wahlweise in Maskennarkose oder Lokalanästhesie wird das benötigte Muskelgewebe aus dem M. deltoideus (Kantenlänge 5x5mm, je 2 Proben) entnommen und zur weiteren Verarbeitung in steriles Transportmedium (Liforlab) eingebracht. In der Einrichtung für Tissue Engineering wird eine Primärkultur angelegt. Dazu werden die Zellen aus dem Gewebeverband ausgelöst, vereinzelt und expandiert. Nach Erreichen eines konfluenten Wachstums erfolgt das Umsetzen auf nächst größere Kulturschalen. Die Transplantation der Zellen erfolgt 59 Tage (range:16-122) nach Biopsie. Transplantiert werden 11.18x106 (0.21-29.23x106) MDC. Davon entfallen 11,3 % (range: 9.5-13.1%) auf Satelitenzellen (MyoD1/a- sarc- actin/a-SM- actin positiv).Das Einbringen der Zellen erfolgt ,eingebracht in physiologischer Kochsalzlösung, endoskopisch unter Sicht  in und um den Sphinkterdefekt. Der Effekt tritt 4,7 Monate (range:2-9) nach Transplantation von MDC auf und bleibt im weiteren Verlauf konstant.

Ergebnisse:
222 männliche Patienten im Alter von 70 (range:56-81) Jahren sind aus 32 verschiedenen Kliniken rekrutiert worden. Bei 132/222 Patienten beträgt die zur Beurteilung erforderliche Nachsorge nach MDC Transplantation mindestens 12 Monate. Der iatrogene Sphinkterdefekt besteht seit 43 Monaten (range:12-192). Bei 15/132 Patienten sind reversible Nebenwirkungen Grad I aufgetreten. Nach einem Mindestnachsorgezeitraum von 12 Monaten (range:12-61) sind 18 Patienten kontinent, bei 51 Patienten liegt eine Besserung der Inkontinenz von Grad III zu Grad I mit einem Urinverlust von < 100ml/24 Stunden vor. 63 Patienten sind unverändert inkontinent.

Schlussfolgerungen:
Die Behandlung mit MDC zur Schließmuskelreparatur ist ein nebenwirkungsarmes und bei 69/132 Patienten erfolgreiches Verfahren zur Behandlung der refraktären postoperativen Harninkontinenz. Nachteile sind der Zeitaufwand von ca. 7 Monaten für den Patienten ,die ausschließlich zu unseren Lasten gehende bislang ungelöste Kostensituation und die Auflagen des §4a AMG , die eine Durchführung GCP konformer Studien untersagt.




 Vermeidung einer Harninkontinenz infolge radikaler retropubischer Prostatovesikulektomie (RRP) durch frühzeitige endoskopische Entfernung der Anastomosennähte

Einleitung:
Im Rahmen einer deutschlandweiten Untersuchung von Sphinkterläsionen nach RP ist bei 46% der Patienten  eine Sphinkterdurchstechung alleinige und vermeidbare Ursache einer persistierenden Harninkontinenz.

Methoden:
Nach radiologischer Prüfung der Anastomose nach RRP auf Dichtigkeit wird die Harnblase mit steriler Kochsalzlösung aufgefüllt und der Katheter entfernt. Als Hinweis auf eine Sphinkterdurchstechung wird ein Strikturflow kombiniert mit einer drittgradigen Harninkontinenz gewertet. Bei der Befundkonstellation erfolgt die endoskopische transurethrale Diagnostik mit Durchtrennung (mittels Turner Wharwick Nadel) und transurethraler Excision der Anastomosennähte am Folgetag.

Ergebnisse:
Von 2004-2008 sind 374 Patienten (mittleres Alter 67 Jahre) mittels RP behandelt worden. Die Nachsorge beträgt 28.5 Monate, die Operationszeit 72 min. (range: 46-120) bei einer Katheterverweildauer von 8.7 Tagen. 19/374 Patienten weisen postoperativ direkt nach Katheterentfernung die Befundkonstellation einer Sphinkterdurchstechung auf. Am Folgetag  erfolgt bei 19/19 Patienten eine endoskopisch geführte transurethrale Fadendurchtrennung und Entfernung (Operationszeit 11 min, range: 5-17). 15/19 Patienten weisen eine alleinige Sphinkterdurchstechung auf. 4/19 Patienten haben zusätzlich eine Sphinkterläsion. Postoperativ erfolgt die Kathetereinlage für 1 Tag. 15/19 Patienten sind 6 Monate postoperativ kontinent. 4/19 Patienten sind drittgradig inkontinent. 2/4 Patienten mit nachgewiesener Sphinkterläsion sind nach autologem Myoblastentransfer und 2 weitere Patienten nach Implantation eines artefiziellen Sphinkters kontinent.  

Schlussfolgerung:
Klinisch weist ein Strikturflow bei gleichzeitiger Inkontinenz auf eine Sphinkterdurchstechung hin. Durch frühzeitige endoskopische Entfernung der Anastomosennähte ist die Inkontinenzrate in unserem Patientengut auf 4/374 (1%) gesenkt worden.




 Bioverträglichkeit alloplastischer Materialien in der Kontinenz- und Hernienchirurgie

Einleitung:
In der Hernien-, Kontinenz- und Prolapschirurgie finden alloplastische Materialien breite Anwendung. GCP- gerechte Studien sind rechtlich nicht gefordert und fehlen demzufolge. Eine Warnmitteilung der amerikanischen Gesundheitsbehörde (www.fda.gov/cdrh/safety/102008-surgicalmesh.html) und eine Mitteilung im Deutschen Ärzteblatt berichten über mehr als 1000 unerwartete und schwere Nebenwirkungen (Deutsches Ärzteblatt 106(34-35),A1654,2009).
 
Methoden:
Zur klinischen Beantwortung der Frage ,ob alloplastische Materialien Fremdkörperreaktionen hervorrufen, haben wir unterschiedliche Netze nach Auftreten klinischer Beschwerden explantiert und histopathologisch/ immunhistochemisch mit der Reaktion auf einen klassischen Fremdkörper im kleinen Becken - einem explantierten19 Jahre alten Bauchtuch -verglichen. Die zelluläre Reaktion im Fremdmaterial wurde mit Antikörpern gerichtet gegen CD68 ( Markierung von Histiozyten und Fremdkörperriesenzellen), Vimentin (Markierung von Fibroblasten), CD34 (Markierung von Gefäßendothel) und Antikörpern gegen glattmuskuläres Aktin (Markierung von Gefäßsprossen und Gefäßwände) ermittelt.

Ergebnisse:
Untersucht sind alloplastische Materialien bestehend aus Polypropylen , titanisiertem PTFE, Polydioxanone und Surgimesh.
Anlass der Resektion des alloplastischen Materials ist in 2 Fällen der frustran verlaufender Versuch einer pelvinen Lymphadenektomie bei Zustand nach Leistenhernienversorgung, in 1 Fall eine Semikastratio infolge therapierefraktärer Schmerzen nach inguinaler Netzeinlage und in 7 Fällen eine partielle Netzresektion nach Inkontinenz und Prolapschirurgie bei persistierender Harninkontinenz und chronischem Beckenschmerz. Die gemessenen Veränderungen sind Netztyp- unabhängig. Immunhistochemisch besteht eine ausgeprägte Fremdkörperreaktion mit dem Nachweis von Histiocyten und Fremdkörperriesenzellen. Es zeigt sich eine ausgeprägte Vimentin positive Reaktion zellarmen umgebenden Bindegewebes mit dem Nachweis vereinzelter Gefäßsprossen und Endothelzellen. Im Unterschied zum corpus alienum ist die leukozytäre Infiltration bei den alloplastischen Materialien geringer ausgeprägt bis fehlend bei ansonsten vergleichbarer immunhistochemischer Begleitreaktion im Sinne einer zellarmen Fibrosereaktion.

Schlussfolgerung:
Die Biokompatibilität ist unabhängig vom explantierten Netztyp schlecht und der klassischen T-Zell vermittelten Fremdkörperreaktion vergleichbar. Auch unter Beachtung einer ungünstigen Patientenselektion mit netzbedingten Grad 4 Nebenwirkungen  ist ein GCP konformes Vorgehen im Umgang mit alloplastischen Materialien in der Inkontinenz- Prolaps-und Hernienchirurgie dringend geboten.




 Verbesserung der Bioverträglichkeit alloplastischen Materials in der Kontinenz- und Prolapschirurgie

Einleitung:
Die amerikanische Gesundheitsbehörde FDA veröffentlicht vor dem Hintergrund von mehr als 1000 gemeldeten schweren Nebenwirkungen eine Warnung im Umgang mit alloplastischen Materialien in der Kontinenz- und Prolapschirurgie der Frau.
Wir stellen eine Methode zur Verbesserung der Biokompatibilität von Fremdmaterialien vor.

Methodik:
Von 12 Patienten wird nach Vorlage einer schriftlichen Einverständniserklärung  jeweils 10 ml Vollblut, Plasma und Serum asserviert. Myoblasten , Endothelzellen und Fibroblasten  desselben Patienten werden getrennt kultiviert. Jeder Versuch erfolgt getrennt für die verschiedenen Zelltypen im Doppelansatz unter identischen Bedingungen der Zellkultur und der verwandten Zellzahl. Adhärenz und Zellzahl werden lichtmikroskopisch sowie immunhistochemisch in Abhängigkeit vom jeweiligen Netztyp semiquantitativ (++/+/-) beurteilt (Der Urologe Suppl 1:15,2009).

Ergebnisse:
Das Zelladhäsionsverhalten ist sind unabhängig vom Geschlecht und jeweiligen Patienten.
Gewebespezifisch besteht ein unterschiedliches Zellwachstum zugunsten der Fibroblasten: Fibroblasten > Myoblasten > Endothelzellen.
Autolog mit Plasma beschichtete Netze weisen im Vergleich zu nicht modifizierten Netzen ein verbessertes Zelladhäsionsverhalten für alle drei Zelltypen auf. Eine Serum- oder Kollagenbeschichtung ist nachteilig.
Bewertet man die Netze nach Ausprägung der Zelladhäsion so ergibt sich das folgende Ranking:
1.    Dynamesh®,  Dahlhausen
2.    TFT Motifmesh ®,  ProxyBiomedical
3.    Surgimesh ®, Aspide Medical, Resorba
4.    PDS Plate ®, Johnson & Johnson
5.    Mersilene Band, Johnson & Johnson
6.    Vitamesh ®, ProxyBiomedical
7.    Vicryl Band, Johnson & Johnson
8.    TiLoop ®,  PFM
Die nachstehenden Materialien führen (un)beschichtet zu keiner Zelladhäsion:
Ethisorb Patch ®,  Ethicon
Proceed surgical mesh ®, Ethicon
Collagenmesh
Resodont mesh ®, Resorba
Parasorb mesh ®, Resorba
Dualmesh®, Fa.Gore
Mycromesh®, Fa.Gore
PCL scaffold
AdVance male sling ®, AMS
Seratim®, Serag-Wiessner

Schlussfolgerung:
Die im Beckenboden vorkommenden Zelltypen haften sich an alloplastische Materialien nur unzureichend an, was die Fremdkörperreaktion und fehlende Integration in den Beckenboden erklärt. Eine autologe Plasmabeschichtung führt zu einer verbesserten Zelladhäsion.




 Der Ileumpouch  - Eine neue Form der Harnableitung

Einleitung:
Der Ileocoecalpouch mit Appendix- oder Indiananippel ist die etablierte , katheterisierbare, kontinente Standardharnableitungen. Mögliche Nachteile beruhen auf der Verwendung des Ileocoecalsegmentes . Dies sind der Wegfall der Bauhinschen Klappe mit konsekutiver Durchmischung von Dick-und Dünndarm sowie der Ausfall des terminalen Ileums für die Vitaminresorption.
Potentielle Vorteile eines reinen Ileumpouches basieren auf den excellenten und langjährigen Erfahrungen im Zusammenhang mit der Ileumneoblase. Technisch ist die Dünndarmenteroanastomose vergleichbar einfacher als eine Ileoascendostomie und das operative Gesamtverfahren im Vergleich zum Ileocoecalpouch deutlich verkürzt. Auch hat die Technik der Ileumneoblase größere Verbreitung und höhere Akzeptanz nicht nur im deutschsprachigen Raum gefunden. Wir stellen erstmals Ergebnisse zu einem Ileumpouch mit katheterisierbarem Nabelzugang vor.

Methodik:
Wir verwenden die Neoblasentechnik nach Studer mit Seit zu Seit Anastomose der geschienten Harnleiter in ein 5cm kurzes Steigrohr. Zuvor haben wir ein 7 cm kurzes, proximales Ileumsegment ausgeschaltet und über einen 10 Ch. Katheter mittels Prolene 2-0 fortlaufender Naht invaginierend plikiert. Nach Fixierung des Ileumpouches mittels Vicryl 3-0 Nähten an der lateralen rechten Oberbauchwand erfolgt am höchsten Punkt (Scheitelpunkt) des Pouches eine ovaläre Eröffnung. Das zuvor plikierte Ileumsegment wird mit 4 Vicryl 3-0 evertierenden Einzelknopfnähten  mit dem Pouch anastomosiert und der 10 Ch. Katheter nach Durchzug durch den Nabel mit 5 ml im Pouch geblockt Die Fixierung des Ileumsegmentes im Nabel erfolgt mittels Monocryl 3-0 Einzelknopfnähten. Der Pouch wird über einen 22 Ch. Katheter drainiert, der über die rechte laterale Bauchwand ausgeleitet wird. Die Entfernung der Harnleiterschienen erfolgt am 7. postoperativen (pop) Tag. Die Katheterisierung des Nabelstomas mit 12 Ch. Thiemannkatheter erfolgt nach radiologischer Prüfung des Pouches auf Dichtigkeit am 14.pop. Die Entfernung des Pouchkatheters erfolgt nach Beherrschung des Selbstkatheterismus am 16.pop.

Resultate:
16 Patienten, davon 6 Frauen haben einen Ileumpouch erhalten. Das mittlereAlter beträgt 61.2 Jahre (range:51-70).Die Nachsorge beträgt 25 Monate (range:6-44).Indikation zur Harnableitung ist bei 3 Patienten ein chronic pelvic pain Syndrom mit drittgradiger Harninkontinenz. Bei 2 Patienten besteht ein lokaler Progress im Bereich der urethralen Anastomose bei Neoblase. Bei einer Patientin besteht eine Neoblase ohne funktionsfähigen Sphinkter. Hier ist jeweils eine Undiversion unter Verwendung von Anteilen der Neoblase erfolgt. 10Patienten erhalten bei lokal fortgeschrittenem Urothelkarzinom die primäre Anlage eines Ileumpouches. Die Gesamtoperationszeit beträgt 193 min. (range:143-240). Eine Blutsubstitution war prae- wie postoperativ nicht erforderlich. Die Katheterisierung erfolgt im Mittel am 12. pop (range:10-14). Der Pouch hat bereits 6 Monate pop. ein Volumen von 698ml. Eine behandlungsbedürftige metabolische Azidose ist nicht beobachtet worden. Bei 1/16 Patienten ist eine Nippelrevision infolge Insuffizienz erfolgt. Bei einer weiteren Patientin erfolgte eine Pouchrevision infolge unvollständiger Entleerung.
Bei 3 stündlichen Katheterisierungsintervallen tagsüber und 4 stdl. Intervallen nachts sind 16/16 Patienten 6 Monate pop. kontinent.

Schlussfolgerung:
Der Ileumpouch ist eine leicht zu erlernende erstmals beschriebene Alternative zum Ileocoecalpouch und verkürzt die Katheterverweildauer und damit die Gesamtbehandlungszeit.




 Prospektive Untersuchung zum Einfluss multiperforierter Katheter bei der radikalen retropubischen Prostatovesikulektomie (RRP)

Multiperforierte Harnblasenkatheter dienen der zusätzlichen Drainage von Anastomosen.
Unbekannt ist der Einfluss multiperforierter Katheter auf die Anastomosenverhältnisse nach RRP. Prospektiv verglichen wird der Einfluss multiperforierter Katheter im Vergleich zu Standardkathetern auf die Katheterverweildauer nach RRP.

Methodik:
Alle Eingriffe erfolgen durch den selben Operateur in deszendierender Technik. Der Blasenhals bleibt präparationsbedingt erhalten. Die Anastomose erfolgt spannungsfrei über 4 evertierende Vicryl 2-0 Nähte. Der Katheter wird mit 50 ml geblockt. Der Katheter wird in Abhängigkeit vom Cystogramm nicht vor dem 7. postoperativen Tag entfernt Verglichen wird in Gruppe A der Standardkatheter ( Fa.Porget REF AB 6224) mit dem multiperforierten Neoblasenkatheter ( Fa. Uromed 3220.22) in Gruppe B.

Ergebnisse:
Die Operationszeit für die RRP mit Lymphadenektomie beträgt 72 min. (48-92). Die Gruppen sind strukturgleich. Patienten mit pT2 Tumoren weisen positive Absetzungsränder in 4/78 Fällen (5.1%) auf. Lokalisation ist hier jeweils der Absetzungsrand zur Harnröhre. Patienten mit pT3a/b Tumore weisen in 12/41 Fällen (29%) eine R1 Situation auf. Unter Verwendung des 24 Ch. Standardkatheters (Gruppe A) erfolgt die Katheterentfernung 15.3 Tage postoperativ. Mit einem multiperforierten 24Ch Katheter (Gruppe B) wird die Katheterverweildauer auf 10.7 Tage reduziert, was einer Reduktion der Gesamtkatheterverweildauer um 30% entspricht. Unterschiede in Abhängigkeit vom Tumorstadium bestehen nicht, so das die einzige Einflussgröße die Wahl des Katheters ist. Methodisch nicht beeinflusst wird die Krankenhausverweildauer (Gruppe A: 11.3 Tage, Gruppe B: 11.7 Tage), da alle Patienten Möglichkeit/Angebot nutzen bis zur Entfernung des Nahtmaterials im Krankenhaus zu verweilen.

Gruppe A                 R1                  Katheterverweildauer   

RRP n=64        10/64 (15.6%)               15.3 Tage                       

pT2  n=41          2/41 (  4.8%)               15.3 Tage

pT3  n=23          8/23 (34.7%)               15.3 Tage

Gruppe B

RRP n=55         6/55 (10.9%)                10.7 Tage                      

pT2  n=37         2/37 (  5.4%)                10.4 Tage

pT3  n=18         4/18 (22.2%)                11.2 Tage

Schlussfolgerung:
Die Verwendung multiperforierter Harnblasenkatheter verkürzt die Katheterverweildauer und damit die Gesamtbehandlungszeit.




 Nephrocutaneous bypass in ureteral obstruction

Purpose:
To describe our experiences with nephrocutaneous bypass and to assess
the role of this procedure as mean of urinary diversion in patients with incurable
ureteral obstruction who are not appropriate candidates for subcutaneous
pyelovesical bypass.

Material and Methods:
Nephrocutaneous bypass was performed on 15 (12 male, 3 female) patients with incurable ureteral obstruction of malignant (n=13, 87%) or benign (n=2, 13%) etiology. Only patients with a significant disturbance of the bladder/sphincter-system were eligible for the procedure.

Results:
In total, 29 stents were applied using this technique. No major complications were observed perioperatively. The operating time for bilateral nephrocutaneous bypass was 74 (46-102) minutes and for unilateral (1 patient) 38 minutes. Time of indwelling percutaneous nephrostomy (PCN) prior to application of nephrocutaneous bypass was 190 (40-870) days. The surviving patients have a mean follow-up of 27 months whereas for those patients who died the mean follow up was 7.8 months. Nephrocutaneous bypass resulted in an improved renal function in all patients. Quality of life improvement was reported by all patients, the objective criteria of „useful life“ were met by 13 patients (87%).

Conclusion:
Nephrocutaneous bypass is a safe and feasible method to provide
effective pyelovesical drainage of urine in patients who have a short-term life
expectancy, who are in poor general conditions or otherwise would need a
permanent nephrostomy drainage. The technique offers patients a higher mobility,
increased independence resulting in higher quality of life during their final period of
life and may also be applied in non-malignant patients after careful consideration of
alternative urinary diversions.




 Feasibility of sequential use of sunitinib and temsirolimus in advanced renal
cell carcinoma


Purpose:
Targeted agents sunitinib and temsirolimus are effective in advanced renal
cell carcinoma. Treatment algorithms for single-agent use have been proposed in
order to optimize timing and type of therapy. The aim of this study was to investigate
the tolerability and adverse event profile of patients who received sunitinib and
temsirolimus in sequence.

Material and Methods:
We performed a retrospective analysis of patients with advanced renal cell carcinoma who received temsirolimus after disease progression under sunitinib therapy. Dosages of both drugs were in accordance with the recommendations given by the respective manufacturers. Temsirolimus was provided before its official approval within a compassionate use program. Adverse event assessment followed the National Cancer Institute Common Toxicity Criteria.

Results:
Thirteen patients receiving temsirolimus after progression under sunitinib
were identified. Overall treatment time with targeted drugs (sunitinib/ temsirolimus)
was 34,8 (17-78) weeks, treatment with sunitinib was 28,6 (12-72) and with
temsirolimus 6,2 (2–16) weeks respectively whereas mean therapy interruption time
between both approaches was 4,4 (2-12) weeks. Under sunitinib, we observed 52
transient adverse events, 49 (94,2%) were of grade I/II ,whereas 3 (5,8%) were of
grade III. Under temsirolimus 36 adverse events, only grade I/II in nature were
remarked.

Conclusion:
Sequential use of temsirolimus after progression under sunitinib seems to be feasible and results in a predictable, medically manageable side effect profile. Further evaluation is necessary to define the oncological validity of this sequencing approach.




  Diamond nano particles (DN) for labeling of satellite cells and myoblast

Introduction:
Cell labeling and imaging are important for in vivo experiments with regard to display different types of cells involved in muscle regeneration after application into the external urethral sphincter. New methods are required to demonstrate cell integration processes. Diamond nano particles (DN) consist of natural carbon nanomaterial. DN are non toxic and are considered to have potential for various biological applications. DN are incorporated into cells by macropinocytosis and clathrin-mediated endocytosis pathways. We investigated DN labeled satellite cells and myoblasts with regard to cell growth and cell division in a in vitro assay.

Material and Methods:
DN were washed in alcohol. At sizes of 20-200nm the particles were assimilated in medium (DMEM / F12 + 5% Glutamin +5 % Pen / Strep + 10 % FCS). We assimilated myoblasts (2x106 and 3x106 cells respectively) from muscle tissue of two male patients aged 63 and 69 years. Both primary cell cultures originated from residual, not used cells initially cultivated and expanded for sphincter reconstruction with muscle derived cells. Two approaches were conducted. Medium was expanded with DN in 8 different well templates, incubated in a dark chamber for 24, 48 and 120hrs (single approach). In an additional double approach we used 2x8 well templates for cell fixation and assessment in darkfield and 2x8 well templates, respectively, for cell washing and incubation with medium in a drying chamber. After incubation cells were examined with regard to morphologic changes, growth, appearance after cell division. Cell vitality was assessed by use of trypan blue.

Results:
Cell investigation after the different time points revealed that compared to non-labeled cells approximately 90% of the cells incubated with DN were tainted with „small particles“ (40nm) after 24 hrs. After 48 hrs an increasing number of diamond particles was assimilated, only few free diamond nano particles could be observed due to the prior assimilation. We did not observe free particles after 120 hrs, in addition, „big particles“ (200nm) were also  assimilated by the cells. Cells coated with diamond nano particles showed a minimally decelerated growth in one case and normal cell growth in an additional specimen holder. Diamond nano particles were detectable in daughter cells after cell division. After short term cell culture no cellular damage was observed. Stressed cells showed an increased development of vacuoles after 5 days (Fig.1), stressed cells in plasma showed development of myofibers .


 Fig.1: DN labeled cells (x200)

Conclusion:
Diamond nano particles (DN) seem to be non toxic in cell division and cell differentiation. In vitro results show that use of diamond nano particles for tracking and labeling of myoblasts and satellite cells is feasible. Establishing of homogeneous, small nano particles seems to be of advantage (<40nm).




  The role of Neowater® for Cryopreservation in primary cell culture

Introduction:
Neowater® is a water-based nano-reagent which consists of water containing and extremely low (nMol) concentration of nanoparticles. Those nanoparticles serve as nuclei for hydration shells of bound water molecules. The presence of durable water-coated nanoparticles induces long-range correlations in liquid water and thus has influence on the surface interaction of water. This results in a significant effect on the activity and the temporal stability of enzymes (ß Galactosidase, alkaline phosphatase) and has possible value in the field of tissue engineering.
We investigated the effect of Neowater® in combination with X-factor (Saccharose, Glycerin, Trehalose, Methyl-cellulose formulation) in the freezing process of primary cultured muscle derived cells.

Material and Methods:
We characterized two different dilutions for cryopreservation.
  • Dilution 1 consisted of Neowater®, Saccharose, Glycerin, Trehalose, Methylcellulose.
  • Dilution 2 consisted of FCS plus 10% DMSO, respectively.

We assimilated myoblasts (2x106 and 3x106 cells respectively) from muscle tissue of two male patients aged 63 and 69 years. Both primary cell cultures originated from residual, not used cells initially cultivated and expanded for sphincter reconstruction with muscle derived cells (MDC). Cells were washed in PBS, incubated and separated in TRYP LE (Fa. Gibco). The viability of the cells is 100%. After centrifugation the cell pellets were assimilated in dilution 1: FCS plus 10% DMSO versus dilution 2: Neowater® plus X-factor and subsequently cryoconservated stepwise at up to –196°C. After assembling cells were quickly unfreezed and placed in Medium* (high dilution factor) subsequently followed by centrifugation und placing of the cell pellets in a cell culture bottle with medium and a dry incubator. Vitality index of cells was assessed.

Results:
Vitality index (vital/ non-vital cells) depending on the freezing medium revealed the following results: after incubation over 24 hrs in Neowater® plus X-factor we observed 8% vital cells in both individuals (vitality index 0.08) whereas incubation with FCS plus 10% DMSO showed a vitality index of 1.04 with 51% vital cells.
After 48 hrs the results were consistent.          

Conclusion:
Compared to standard freezing medium, Neowater® shows significantly worse results concerning cell vitality and is therefore not recommended for use in freezing process of   myoblasts and satellite cells.




  Shipment optimization in Tissue Engineering
Neowater + X factor® vs  Eurocollins®  vs  Liforlab®


Introduction:
Neowater® is a water-based nano-reagent which consists of water containing and extremely low (nMol) concentration of nanoparticles. Those nanoparticles serve as nuclei for hydration shells of bound water molecules. The presence of durable water-coated nanoparticles induces long-range correlations in  liquid  water  and  thus  has  influence  on  the  surface  interaction  of  water.  This results in a significant effect on the activity and the temporal stability of enzymes (ß Galactosidase, alkaline phosphatase) and has possible value in the field of tissue engineering and organ preservation.
We investigated the effect of Neowater® + X-factor (Saccharose, Glycerin, Trehalose, Methyl-cellulose ) concerning transport characteristics for tissue probes for primary cell culture.

Material and Methods:
We evaluated the following 3 different transport dilutions:
  1. Eurocollins®  (Fresenius),
  2. Liforlab®  (Oncoscience) and
  3. Neowater®   + X-factor (Saccharose, + Glycerin, + Trehalose + Methyl-cellulose).
After written informed consent we assimilated muscle tissue ( size of each probe: 1.0 cm x 1.0 cm, 3 samples/patient) of one male patient and one female patient aged 65 and 71 years. The samples are stored in sterile medium using the three different dilutions.  Tissue   was transported after extraction from the operation theatre to Institute for Tissue Engineering and regenerative Medicine – ITERM which is located on the same floor. Incubation time at room temperature in the respective dilution from explantation to culturing was 24 hrs. Subsequently processing and raising of cells was conducted in primary cell culture disposables.

Results:
After seven days we evaluated the different dilutions regarding cell growth and cell vitality. Neowater® plus x-factor showed necrotic tissue with additional contamination of all samples. Cells collected in Eurocollins® showed necrosis, no cell growth. Cells transported in Liforlab® were organized in clusters showing vitality in > 90% of the cells.

Conclusion:
Liforlab®  has shown best results for transport of muscle cell tissue and proven superiority compared to Eurocollins® and Neowater®. Muscle tissue transport with Eurocollins® dilution or Neowater® is not feasible.




 The ileal pouch with catheterisable umbilical stoma

Introduction:
The ileocoecal pouch with appendix or Indiana nipple is considered the standard for continent catheterisable urinary diversion. Possible disadvantages are associated with the use of the ileocoecal segment. We present our initial results with the ileal pouch with catheterisable umbilical ileal nipple.

Methods:
The surgery includes the technique for neobladder formation according to Studer. Priorly a short ileal proximal segment is disconnected and temporarily stented by a 10 F catheter. Subsequently, the segment is sutured continuously creating an invagination of the segment around the catheter. After the fixation of the ileal pouch to the right lateral and upper abdominal wall, the ileal pouch is created at the most proximal spot. The prepared invaginated ileal segment is connected to the oval opening of the pouch by everting individual sutures. The 10 F catheter is used as a stenting device and blocked in the pouch. The fixation of the ileal segment to the umbilical nipple is conducted by individual sutures. The pouch is drained by a 22 F catheter which is diverted through the right abdominal wall. The removal of the ureteral stents takes place during the 7th postoperative day. Catheterisation of the pouch begins during the 12th postoperative day after radiological check up for impermeability. On the 16th day postoperatively, the pouch catheter can be removed if auto-catheterisation is mastered by the patient.


Fig. scheme and pouchogramm of ileal pouch

Results:
10 men and 6 women received an ileal pouch. Median age of the patients is 63.2 years (51-74). Follow-up was 28 months (9-47). Indications for urinary diversion were chronic pelvic pain syndrome associated with grade III urinary incontinence in 3 patients. 2 patients showed local tumour progression at the urethral anastomosis and 3 patients had a sphincter disturbance after neobladder formation. Ten patients received ileal pouches for locally advanced urothelial carcinoma. Operation time was overall 193 min (143-240). No substitution of blood was necessary perioperatively. Catheterisation started with the 12th postoperative day (10-14). Six months after surgery the maximum volume of the pouch was 698ml (500-980). Metabolic acidosis requiring therapeutical intervention has not been observed. 1/16 patients underwent nipple reconstruction for insufficiency, one patient received a pouch revision and 3/16 patients developed pyelonephritis. Six months after primary surgery 16/16 patients are continent, respective intervals of catheterisation are every 3 hours per day and every 4 hours per night.

Conclusion:
The ileal pouch is a new, feasible and reproducible   alternative to the ileolcoecal variant and can be easily applied.




 Plasma coating improves biocompatibility of meshes used for hernia, incontinence and organ prolapse repair – in vitro and in vivo results

Introduction:
The application of alloplastic materials for surgical treatment of female incontinence, hernia and prolapse may lead to severe adverse events associated with the used materials.
Aim of this project was to optimize alloplastic materials with regard to improved biocompatibility establishing an in vitro and animal model. We present our results of the in vitro approach and show results in vivo approach (animal experiment).

Materials and methods:
An experimental in vitro approach representing the different cellular components of the pelvic floor and abdominal wall has been developed. Human tissue  culture consisting   of muscle, endothelial and fascia tissue/cells were separately cultivated and adhesion ability of the respective cultures was tested on different mesh types.
Same was done with sheep tissue culture consisting of muscle, endothelial and fascia tissue/cells.  Autologous plasma was used in order to modify the alloplastic materials and to improve tissue compatibility. Currently established mesh types were assessed with regard to the specificity of cell adhesion. Meshes with demonstrated in vitro biocompatibility were then transferred into an animal model (sheep, n=14). Therefore we   implanted coated and uncoated versions of every mesh type into the animals allowing an intra-individual comparison. Criteria for assessment were foreign body reaction, scar formation and inflammatory reaction. Meshes were explanted after 3 and 6 months and assessed with regard to the mentioned criteria.

Results:
In the in vitro approach we could show that meshes coated with autologous plasma show an improved cell adhesion for all three investigated cell types in comparison to unmodified meshes without coating. Biological behaviour of human cells is comparable to cells in the sheep model. When evaluating the different meshes with regard to intensity of cell adhesion we could establish a ranking order for meshes. We   implanted coated and uncoated versions of three different mesh types with the following in vitro ranking order:
  1. Dynamesh CICAT= Polyvinylidenedifluoride
  2. Ultrapro= Polypropylene+ Poliglecapron
  3. TVTo = Polypropylene
  4. into 14 animals allowing an intra-individual comparison. We demonstrated significant less foreign body reaction, scar formation and inflammatory reaction for the plasma coated material in each type of mesh after 3 month with the following ranking order:
  1. Dynamesh-CICAT= Polyvinylidenedifluoride
  2. Ultrapro Polypropylene+ Poliglecapron
  3. TVT o= Polypropylene.
We revealed the same ranking 6 months after implantation.
Interestingly the in vitro ranking is same like the in vivo ranking.

Conclusion:
Early and intermediate results from animal experiments 3 and 6 month after implantation support the hypothesis from our in vitro experiments that autologous modification of alloplastic materials by coating with plasma leads to an improvement (clinically as histopathologically) of early integration of the respective material into the different locations.




 Therapy of refractory postoperative urinary stress incontinence by the use of autologous skeletal muscle- derived cells (MDC)

Background:
Urinary stress incontinence caused by morphological injury of the external urethral sphincter is refractory to conservative treatment. According to §4a of the German Pharmaceutical Law (AMG) we treated patients suffering from postoperative refractory grade III urinary stress incontinence by transplantation of MDC. Patients were sent to our clinic from all parts of Germany.

Methods:
In general or local anaesthesia muscle tissue is extracted from the deltoid muscle (sample size 5x5mm, 2 samples/patient). The samples are stored in sterile medium (Liforlab). In our Institute for Tissue Engineering and Regenerative Medicine ITERM the muscle tissue is converted into a primary cell culture separating individual cells and expanding them. After sufficient cell growth MDC are transferred to a bigger conserving device.
After a medium of 59 days (range: 16-122) following the muscle biopsy, transplantation of MDC is performed. 11.18x106 (range: 0.21-29.23x106) of MDC are transplanted. 11.3 % (range: 9.5-13.1%) of these cells are identified immunocytochemically as satellite cells (positive for MyoD1, α-sarcomeric actin, α-smooth-muscle actin). Prior to the transplantation MDC are stored in physiological soda solution. Under visual guidance the cells are endoscopically injected into and around the lesion of the external sphincter.
The treatment effect can be observed 4.7 months (range: 2-9) after transplantation of MDC and remains stable during follow-up.

Results:
222 male patients aged 70 years (range: 56-81) from 32 different hospitals in Germany were included. 60% (132/222) of the patients were followed-up for at least 12 months after MDC transplantation- the time span necessary for sufficient evaluation of the transplantation process.
The average time since iatrogenic sphincter injury was 43 months (range: 12-192). Reversible adverse events grade I were observed in 11% of the patients (15/132). After a minimum follow-up of 12 months (range: 12-61) 18 patients (13.6%) were completely continent, 51 patients (38,6%) showed improvement from grade III urinary stress incontinence to grade I (less than 100ml/24h uncontrolled urine loss). 63 patients (48%) presented with persistent grade III urinary stress incontinence.

Conclusions:
The transplantation of MDC for the repair of iatrogenic damage of the external urinary sphincter and consecutive grade III urinary stress incontinence is a safe procedure. In 52% (69/132) of the patients this minimally invasive method is efficient in distinctively reducing incontinence or even healing it. Disadvantages are the expenditure of time between treatment and efficacy of about 7 months, the cost situation which until today is at our own expense exclusively, and the restrictions resulting from §4a AMG (German Pharmaceutical Law) prohibiting us the initiation of GCP- conform clinical trials.

 

 

 
DAAD/DFG CAIRO
TBRI Cairo/Lukaskrankenhaus Neuss


Die Einrichtung für Tissue Engineering im Lukaskrankenhaus ist eine von wenigen Einrichtungen in Europa, die eine Behandlung unter Vorhaltung von Methoden der regenerativen Medizin durchführt.

Programm zum Download

 





FORSCHUNGSFÖRDERUNG
2009


Fördereinrichtung: Deutsche Forschungsgemeinschaft

Förderkennzeichen: DFG Ot122/4-1

Thema: Standard Operating Procedures for Transplantation Of Cultivated Human Muscle-Derived Cells To Regain Function Of The External Urethral Sphincter.

FORSCHUNGSFÖRDERUNG
2010-2012


Fördereinrichtung: Deutscher Akademischer Austauschdienst

Förderkennzeichen: DAAD 50753662

Thema: Optimierung der Biokompabilität alloplastischer Materialien.